ObjetivosDescrever achados ultra-estruturais do intestino delgado de crianças infectadas pelo HIV.MétodosEstudo descritivo, observacional de biopsias do intestino delgado, realizada entre agosto de 1994 e maio de 1995 em São Paulo - Brasil. Este material pertencia a 11 crianças infectadas pelo HIV e foi armazenado em um laboratório em blocos de parafina. As amostras de intestino delgado foram analisadas por microscopia eletrônica de transmissão e de varredura e achados os achados ultra-estruturais foram descritos por meio da análise de fotos digitalizadas desse material. Foi obtida aprovação pelo Comitê de Ética.ResultadosNa maioria das amostras a microscopia de varredura mostrou vários graus de encurtamento e diminuição do número das microvilosidades e até o completo apagamento dessas estruturas em algumas áreas. O desarranjo dos enterócitos foi visto com freqüência e, por vezes, os limites celulares estavam imprecisos. Em algumas áreas uma membrana fibrino-mucosa com espessura e extensão variáveis aparentava revestir parcial ou totalmente a superfície epitelial. Gotas de gordura no lúmen intestinal estavam presentes em várias amostras e bactérias morfologicamente semelhantes a bacilos foram observadas em duas amostras. A microscopia eletrônica de varredura confirmou as observações constatadas nas microvilosidades através da microscopia de transmissão e também mostrou pequenos “tufos” dessas estruturas. Além disso, mostrou aumento do número de vacúolos e de formações multivesiculares dentro de vários enterócitos, aumento da presença de linfócitos intraepiteliais, vacuolização mitocondrial e alargamento da membrana basal na maioria das amostras analisadas. No entanto, algumas amostras apresentavam-se com aspecto normal.ConclusõesNosso estudo mostrou a ocorrência comum de várias alterações ultra-estruturais intestinais importantes e de intensidade variável entre crianças infectadas pelo HIV, algumas delas, ao nosso conhecimento, não descritas anteriormente.

ObjectivesTo describe HIV children's small intestinal ultrastructural findings.MethodsDescriptive, observational study of small intestine biopsies performed between August 1994 and May 1995 at São Paulo, SP, Brazil. This material pertained to 11 HIV infected children and was stored in a laboratory in paraffin blocks. Scanning and transmission electronic microscopy were used to view those intestine samples and ultrastructural findings were described by analyzing digitalized photos of this material. Ethical Committee approval was obtained.ResultsIn most samples scanning microscopy showed various degrees of shortening and decreasing number of microvilli and also completes effacements in some areas. Derangement of the enterocytes was seen frequently and sometimes cells well defined borders limits seemed to be loosened. In some areas a mucous-fibrin like membrane with variable thickness and extension appeared to partially or totally coat the epithelial surface. Fat drops were present in the intestinal lumen in various samples and a bacterium morphologically resembling bacilli was seen in two occasions. Scanning microscopy confirmed transmission microscopy microvilli findings and also showed little “tufts” of those structures. In addition, it showed an increased number of vacuoles and multivesicular bodies inside various enterocytes, an increased presence of intraepithelial lymphocytes, mitochondrial vacuolization and basement membrane enlargement in the majority of samples analyzed. However, some samples exhibited normal aspect.ConclusionsOur study showed the common occurrence of various important intestinal ultrastructural alterations with variable degrees among HIV infected children, some of them in our knowledge not described before.

OBJETIVO: Estudo morfológico que buscou verificar, por meio de microscopia eletrônica, a presença de aferências de receptores sino-aórticos em núcleo localizado na região dorso-lateral bulbar. MÉTODOS: Após 5 dias de sobrevida, 9 ratos com desnervação sino-aórtica anestesiados com equitesina foram submetidos à perfusão transcardíaca, e o encéfalo de cada um deles foi processado histologicamente. RESULTADOS: A citoarquitetura neuronal do núcleo paratrigeminal compreende projeções aferentes de outros núcleos que apresentam uma característica distributiva em relação às funções viscerais e nociceptivas na integração do reflexo cardiovascular. CONCLUSÃO: A porção medial do núcleo recebe projeções aferentes da região rostro-ventrolateral do troncoencefálico, confirmadas por meio de estudos com rastreadores neuronais. Os resultados indicam que a região medial do núcleo paratrigeminal contém o maior número de fibras axonais degeneradas.

OBJECTIVE: Morphological study that searched to authenticate the presence of sinoaortic baroreceptor inputs within the dorsolateral medullary nucleus under electron microscopy analysis. METHODS: After a 5-day survival period, 9 baroreceptor-denervated rats deeply anaesthetized with equithesin were transcardially perfused and their brains were histologically processed. RESULTS: The neuronal cytoarchitecture of the paratrigeminal nucleus comprehends afferent projections from other nuclei that have a distributive character regarding visceral and nociceptive functions in the cardiovascular reflex integration response. CONCLUSION: The medial portion of the nucleus receives afferent projections of the rostral ventrolateral medulla, as shown by retrograde neurotracing studies. The present results show that the medial extent of the paratrigeminal nucleus contains degenerated axoplasmic cellular components in sinoaortic deafferented rats. The number of degenerated axonal fibers was also larger in this area of the nucleus.

OBJETIVO: Avaliar a eficácia e aspecto estrutural de células límbicas epiteliais humanas cultivadas sobre membrana amniótica (MA) com e sem epitélio. MÉTODOS: As culturas límbicas foram obtidas a partir de rima corneoescleral remanescentes de transplantes de córnea de 6 diferentes doadores. Cada explante foi cultivado em três diferentes grupos: MA desepitelizada por tripsina (Grupo 1), MA com epitélio íntegro (Grupo 2) e controle (Grupo 3). A migração epitelial foi avaliada por microscopia de contraste de fase. Após 15 dias, as células cultivadas sobre MA foram submetidas à microscopia eletrônica para avaliar migração e adesão epitelial. RESULTADOS: Todas as células do grupo controle cresceram até atingir confluência. Somente uma das culturas em membrana amniótica desepitelizada não apresentou crescimento epitelial. O crescimento de células epiteliais sobre membrana amniótica epitelizada foi observada em apenas uma cultura. CONCLUSÃO: Baseando-se nestes achados, o uso de membrana amniótica desepitelizada aparenta ser o melhor substrato para migração e adesão epitelial comparando com membrana amniótica epitelizada. Remover o epitélio da membrana amniótica demonstra ser um importante passo para estabelecer culturas de células sobre membrana amniótica.

PURPOSE: To evaluate the efficacy and ultrastructural aspects of human limbal epithelial cells cultured on amniotic membrane (AM) with and without epithelium. METHODS: Limbal epithelial cell cultures were established from cadaveric cor neo-scleral rim explants derived from 6 different donors. The explants from each donor were placed under 3 different groups: on human preserved AM with epithelium (Group 1), AM deepithelialized with trypsin (Group 2) and control (Group 3). The epithelial cell migration was evaluated under phase contrast microscopy. After 15 days, the amniotic membrane with cells cultures were removed and submitted to scanning and transmission electron microscopy to check for epithelial migration and adhesion. RESULTS: All epithelial cell cultures from the controls grew over the botton of the culture plate wells until reaching confluence. Epithelial cultures grew over all but one denuded amniotic membrane. In the group amniotic membrane with epithelium, epithelial cell growing was observed only in 1 well. CONCLUSIONS: Using this model, denuded amniotic membrane appeared to be the best substrate for epithelial cell migration and adhesion comparing to amniotic membrane with epithelium. Removal of amniotic membrane epithelial seems to be an important step for establishing limbal epithelial cell culture on amniotic membrane.

OBJETIVO: Avaliar interações de amostras de Escherichia coli enteroagregativa com tecido intestinal humano, a fim de documentar potenciais alterações em diferentes regiões do trato digestivo. MÉTODOS: Amostras de Escherichia coli enteroagregativa isoladas das fezes de crianças com diarreia persistente e a amostra protótipo 042, isolada de uma criança com diarreia em Lima, no Peru (controle positivo), foram analisadas por microscopia óptica de luz após semeadura em cultura de orgão in vitro de fragmentos de mucosa ileal e colônica. Foram analisadas as interações entre as diferentes cepas de Escherichia coli enteroagregativa e as mucosas ileal e colônica. RESULTADOS: A análise por microscopia óptica de luz indicou associação destes micro-organismos com o epitélio, provocando alterações. As cepas estudadas aderiram a ambas as regiões avaliadas (intestino delgado distal e grosso) e causaram alterações, especialmente naquelas áreas onde interagiram diretamente com o epitélio. No íleo, algumas regiões mostraram internalização secundária. CONCLUSÕES: Esses agentes podem causar diarreia persistente por meio de alterações no intestino delgado, no qual ocorrem as funções digestivo-absortivas. As lesões inflamatórias descritas na mucosa colônica poderiam explicar a colite mostrada em algumas crianças infectadas por Escherichia coli enteroagregativa.

OBJECTIVE: To examine the interactions of Enteroaggregative Escherichia coli strains with small and large intestinal mucosa, in order to detect potential alterations in both regions of the digestive tract. METHODS: Enteroaggregative Escherichia coli strains, isolated from stools of infants with persistent diarrhea and the prototype strain 042 (O44:H18), isolated from a child with diarrhea in Lima, Peru (positive control), were analised by light microscopy after in vitro organ culture assay of ileal and colonic mucosa. The interactions between the different enteroaggregative Escherichia coli strains and the ileal and colonic mucosa were analysed. RESULTS: Light microscopy analysis suggested an association of enteroaggregative Escherichia coli strains with the epithelium, inducing alterations. These bacteria adhered to both small and large bowel mucosa. The enteroaggregative Escherichia coli strains induced alterations in those areas where they were directly interacting with the epithelium. In the ileum, some areas showed a secondary internalization. CONCLUSIONS: The enteroaggregative Escherichia coli strains could cause persistent diarrhea inducing alterations in the small intestinal structures, where the digestive-absorptive functions take place. Inflammatory lesions observed in colons could justify the colitis described in some children infected by enteroaggregative Escherichia coli.

OBJETIVO: Evaluar interacciones de muestras de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) con tejido intestinal humano, a fin de documentar potenciales alteraciones en distintas regiones del tracto digestivo (intestino delgado distal e intestino grueso) y definir, con eso, su rol en la persistencia del proceso diarreico. MÉTODOS: Muestras de EAEC aislada de las heces de niños con diarrea persistente y la muestra prototipo 042, aislada de un niño con diarrea en Lima, Perú (control positivo) fueron analizadas por microscopía óptica de luz (ML) después de siembra en cultura de órgano in vitro de fragmentos de mucosa ileal y del colon. Fueron analizadas las interacciones entra las distintas cepas de EAEC y las mucosas ileal y del colon. RESULTADOS: El análisis por ML indicó asociación de estos microorganismos con el epitelio, provocando alteraciones. Las cepas estudiadas adhirieron a ambas regiones evaluadas: intestino delgado distal y grueso y causaron alteraciones, especialmente en aquellas áreas donde interactuaron directamente con el epitelio. En el íleo, algunas regiones mostraron internalización secundaria. CONCLUSIÓN: Estos agentes pueden causar diarrea persistente mediante alteraciones en el intestino delgado, donde ocurren las funciones digestivo-absortibas. Las lesiones inflamatorias descritas en la mucosa del colon podrían explicar la colitis descrita en algunos niños infectados por EAEC.

OBJETIVO: Avaliar a eficácia da liofilização da membrana amniótica (MA) para a reconstrução da superfície ocular em coelhos. MÉTODOS: A liofilização é processo de preservação que mantém a MA estável durante longo tempo mesmo em temperatura ambiente. A córnea de um olho de cada coelho macho da raça Nova Zelândia foi marcada e desepitelizada. Essa área desepitelizada foi coberta com: Grupo 1: MA criopreservada (n=6); Grupo 2: MA liofilizada (n=6) e Grupo 3: Não coberta (n=3). A MA nos grupos 1 e 2 e a periferia da córnea no grupo 3 foram suturadas com nylon 10-0. A avaliação clínica foi realizada por um observador cego em relação à hiperemia, neovascularização e edema de córnea e reepitelização nos dia 1, 7 e 30 pós-operatórios. Após o dia 30 os ratos foram eutanizados e suas córneas enviadas para análise histopatológica e ultra-estrutural. RESULTADOS: Dois olhos no grupo 2 foram excluídos da análise devido à infecção. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos em relação à avaliação clínica. Na microscopia eletrônica de transmissão, a membrana basal nos grupos de MA liofilizada e controle foi mais contínua e homogênea em relação ao grupo da MA criopreservada. CONCLUSÕES: O processo de liofilização parece ser boa opção para a preservação da membrana amniótica humana para utilização na reconstrução da superfície ocular.

PURPOSE: To determine the efficacy of freeze-dried amniotic membrane (AM) for reconstruction of the ocular surface in rabbit eyes. METHODS: The sterilized, freeze-dried amniotic membrane (lyophilized or FD-AM) is a preservative method that uses the drying by freezing process to maintain the AM well preserved for a long time even at room temperature. This paper is an experimental animal interventional study. One eye of each of 15 male New Zealand rabbits (1.5 - 3.0 kg) had the central cornea marked with a 6.0 mm trephine. The marked area was deepithelialized with a No.15 blade. The denuded corneal surface was covered as follows: Group 1: cryopreserved AM (n=6); Group 2: freeze-dried AM (n=6); and Group 3: not covered (control group, n=3). The AM in group 1 and 2 and the periphery of the denuded area in group 3 were secured with continuous 10-0 nylon sutures. The clinical evaluation was made by a blinded observer and graded on a four-point scale (1= minimal, 4= marked) for conjunctival and ciliary hyperemia, eyelid edema, corneal neovascularization, corneal opacity and reepithelialization on postoperative (PO) days 1, 7 and 30 . After PO day 30, the rabbits were euthanized and their corneas were sent for histopathological and ultrastructural analysis to evaluate tissue inflammation, reepithelialization, and basement membrane integrity. RESULTS: Two eyes in group 2 had a corneal infection and were excluded from the analysis. No statistically significant differences among the three groups were found (p>0.05) regarding the clinical evaluation on 1st, 7th and 30th PO days. On transmission electron microscopy, the basement membrane in lyophilized and control groups was more continuous and homogeneous than in the glycerol group. CONCLUSIONS: The freeze-drying method seems to be a good option to preserve human amniotic membrane to be used in ocular surface reconstruction. This preservative method reduces the preservation costs and may enhance the use of AM, facilitating its storage and transport.

OBJETIVO: Comparar, por microscopia eletrônica, a integridade anatômica e a presença de fatores de crescimento e citocinas da membrana amniótica preservada com glicerol/MEM (1:1) e dimetilsulfóxido puro. MÉTODOS: As membranas amnióticas preservadas em glicerol/MEM (1:1) ou dimetilsulfóxido puro foram processadas para microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Como controle, membrana amniótica fresca foi imediatamente fixada após coleta e processada para microscopia eletrônica. As citocinas e os fatores de crescimento avaliados foram: TGF-beta- fator transformador de crescimento beta; TGF-beta ativ- fator transformador de crescimento beta ativado; EGF- fator recombinante de crescimento epitelial humano; FGF-4- fator de crescimento fibroblástico 4; FGF-beta- fator de crescimento fibroblástico básico; IL-4- interleucina 4; PGE2- prostaglandina E2; IL-10- interleucina 10; KGF- fator de crescimento de queratinócito; HGF- fator de crescimento de hepatócito. RESULTADOS: As membranas amnióticas do grupo controle apresentavam epitélio íntegro, com microvilos na superfície e complexos juncionais entre as células e a membrana basal. As membranas amnióticas preservadas em glicerol/MEM tinham aspecto semelhante às do controle, com maior altura das células epiteliais. Já as membranas amnióticas preservadas em dimetilsulfóxido mostraram redução das junções intercelulares e destacamento do epitélio da membrana basal. As citocinas e fatores de crescimento não apresentaram diferenças entre os grupos, exceto FGF-4, FGF-beta, PGE2 e KGF. CONCLUSÕES: A membrana amniótica preservada em meio glicerol/MEM apresentou melhor integridade tecidual, com menor desprendimento do epitélio da membrana basal, em comparação com a preservada no dimetilsulfóxido puro. Os fatores de crescimento e citocinas estavam, em sua maior parte, preservados com as duas técnicas de preservação.

PURPOSE: To compare the anatomical structure and the presence of growth factors and cytokines of amniotic membrane preserved in glycerol/MEM (1:1) or undiluted dimethyl sulfoxide through electron microscopy. METHODS: Amniotic membrane preserved in glycerol/MEM (1:1) or undiluted dimethyl sulfoxide were processed for transmission and scaning electron microscopy. As control, freshly collected amniotic membrane was fixed and processed for electron microscopy. The cytokines and growth factors assessed were: TGF-beta (transforming growth factor beta); TGF-b activ (activated transforming growth factor beta); EGF (epidermal growth factor); FGF-4 (fibroblast growth factor 4); bFGF (basic fibroblast growth factor); IL-4 (interleukin 4); PGE2 (prostaglandin E2); IL-10 (interleukin 10); KGF (keratinocyte growth factor); HGF (hepatocyte growth factor). RESULTS: Amniotic membrane from the control group showed intact epithelium, with surface microvilli and junctional complexes between the cells and the basal membrane. Glycerol/MEM preserved amniotic membrane had similar aspect to the control, with higher epithelial cells. Those amniotic membranes preserved in dimethyl sulfoxide disclosed less intercellular junction and detachment of the epithelium from the basal membrane. The cytokines and growth factors did not disclose significant differences, except for FGF-4, bFGF, PGE2 and KGF. CONCLUSIONS: Amniotic membrane preserved in glycerol/MEM showed a better tissue structure, with less detachment of the epithelium from the basal membrane, in comparison to undiluted dimethyl sulfoxide. The majority of the growth factors and cytokines were kept with both techniques of preservation.

OBJETIVO: Avaliar as características morfológicas da membrana amniótica desepitelizada por diferentes técnicas. MÉTODOS: A membrana amniótica humana foi coletada no momento do parto, fixada em concentrações crescentes de glicerol (0-50% em DMEM) e preservada a 80°C até a hora de ser usada. O estudo consistiu de 4 grupos: epitélio intacto (controle) e membranas desepitelizadas pela tripsina (2 mg/mL a 1:250), dispase (1,2 U/mL em solução salina balanceada de Hank livre de Mg2+ e Ca2+) e ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), 0,02%). As amostras foram submetidas à análise por microscopia eletrônica (de varredura e de transmissão). RESULTADOS: A microscopia eletrônica de varredura mostrou epitélio intacto no grupo controle e sua ausência nas membranas amnióticas desepitelizadas pela tripsina e pela dispase. Naquelas tratadas com o ácido etilenodiaminotetra-acético, havia áreas com e sem epitélio. Quando avaliadas pela microscopia eletrônica de transmissão, o epitélio estava intacto e firmemente aderido à membrana basal através de hemidesmossomos nos grupos controle e em parte do ácido etilenodiaminotetra-acético. Havia apenas fibras colágenas nas membranas tratadas com dispase e tripsina. CONCLUSÕES: O tratamento da membrana amniótica com tripsina e dispase pode causar completa retirada do epitélio e da membrana basal, ao passo que o ácido etileno- diaminotetra-acético pode preservar áreas com epitélio intacto e parcialmente destruir a membrana basal em outras.

PURPOSE: To evaluate the morphological features of the amniotic membrane denuded by different techniques. METHODS: Human amniotic membrane was collected at the time of delivery, fixed in increasing concentrations of glycerol (0-50% in DMEM) and preserved at -80ºC until the time of use. The study consisted of 4 groups: intact epithelium (control) and denuded by trypsin (2 mg/mL at 1:250), dispase (1.2 U/mL in Mg2+ and Ca2+ free Hank's balanced salt solution) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.02%. Specimens were submitted to electron (scanning and transmission) microscopy analysis. RESULTS: Scanning electron microscopy disclosed intact epithelium in the control group and its absence in the amniotic membranes denuded by trypsin and dispase. In those denuded by ethylenediaminetetraacetic acid there were areas with and without epithelium. When assessed by transmission electron microscopy, the epithelium was intact and firmly adhered to the basement membrane by hemidesmossomes in controls and in parts of ethylenediaminetetraacetic acid group. There were only collagen fibers in the dispase- and trypsin-treated groups. CONCLUSIONS: Trypsin and dispase treatment of the amniotic membrane may cause complete denuding of the epithelium and basement membrane whereas ethylenediaminetetraacetic acid may leave some intact epithelium-areas and partially destroy the basement membrane in others.

Estudamos cinco pacientes com leucemia de células pilosas (LCP), diagnosticada nos últimos dez anos na Disciplina de Hematologia da Escola Paulista de Medicina. O principal objetivo foi analisar o valor da microscopia eletrônica de transmissão (MET) pela comparação deste método com os convencionais. Pacientes apresentavam no diagnóstico perda de peso, esplenomegalia e células pilosas (CP) no sangue periférico e medula óssea. As CP foram caracterizadas pela morfologia e resistência ao tartarato na reação de fosfatase ácida (FATR). Na época em que foram avaliados, a quantidade de CP variou de 1 a 85% da leucometria. Todos os pacientes tinham fenótipo B, excetuando-se dois nos quais FATR e imunofenótipo não puderam ser documentados devido ao baixo número de CP no sangue periférico e medula óssea. Projeções citoplasmáticas e ausência de complexo ribosômico lamelar foram os mais freqüentes achados na MET, mesmo nos pacientes com baixa porcentagem de CP. Baseado nestes achados concluímos que MET é um método eficiente no diagnóstico e evolução da LCP.

We studied five patients with hairy cell leukemia (HCL) diagnosed within the last ten years at the Department of Hematology of Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Our purpose was to analyze the value of transmission electron microscopy (TEM) by comparing this method with the conventional ones. At diagnosis, patients presented weight loss, spleen enlargement and hairy cells (HC) in peripheral blood and bone marrow slides. HC was characterized by morphology and tartrate test resistance in the acid phosphatase reaction (TRAP). At the evaluation time, the amount of HC ranged from 1% to 85% of WBC count. All patients, except two, had phenotype B. In these last two, TRAP as well as phenotype B could not be documented due to low HC numbers in their exams. Cytoplasmatic projections and the absence of lamellar ribosomic complex were the most frequent ultrastructural findings, even in those patients with the lowest HC numbers. Based on these features, TEM is an efficient method for searching for HC at HCL diagnosis and during the course of the disease.